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                          细胞总脂肪酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
                          点击次数:24 发布时间:2022-03-09
                           

                          主要用途

                           

                          细胞总脂肪酶(lipase)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解,释放出巯基基团,使用Ellman试剂,产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化即采用比色法来测定样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解样品(动物、人体、植物、昆虫等)脂肪酶的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

                           

                          技术背景

                           

                          脂肪酶(lipaseEC3.1.1.3)是可溶性糖蛋白分子,催化不溶性脂质分子的酯键(ester bond)的水解。在人体中,其来源于胰腺产生。在消化系统中,脂肪酶(Lipase),裂解脂肪分子,例如甘油三酯(triglycerideTAG),产生1个分子甘油(glycerol)和3个分子游离脂肪酸分子(fatty acid)。脂肪酶异常增高与胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、肾病、唾液腺炎症、肠道阻塞等相关;异常降低则与胰腺中脂肪酶产生细胞的性损伤有关。脂肪酶的活性检测是临床诊断的指标之一。基于脂肪酶在水分子的参与下,催化三丁酸二巯基丙醇(dimercaptopropanol tributyrateDMPTBBALB的水解,产生二巯基丙醇(dimercaptopropanolDMP),并释放出巯基基团(-SH),进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid);DTNB]反应后,产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acidTNB,通过其吸收峰值的变化412nm波长),来定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反应系统

                           

                          产品内容

                           

                          清理液(Reagent A           毫升

                          裂解液(Reagent B            毫升

                          缓冲液(Reagent C           毫升

                          反应液(Reagent D           毫升

                          底色液(Reagent E            毫升

                          补充液(Reagent F            毫升

                          产品说明书              1

                           

                          保存方式

                           

                          保存反应液(Reagent D)和底色液(Reagent E在-20冰箱里,其余的保存在4冰箱里;底色液(Reagent E避免光照,有效保证6

                           

                           

                          用户自备

                           

                          1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

                          15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

                          细胞刮脱棒:用于脱离铁壁细胞

                          DOUNCE匀浆器:用于组织裂解

                          微型台式离心机:用于样品制备

                          恒温水槽:用于孵育反应

                          比色皿或96孔板:用于反应和比色的容器

                          分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

                           

                          实验步骤

                           

                          一、 样品准备

                           

                          1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 106细胞)

                          2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆盖生长表面

                          3. 小心抽去清理液

                          4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化

                          5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混匀细胞

                          6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始

                          7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g

                          8. 小心抽去上清液

                          9. 加入xx裂解液(Reagent B,充分混匀

                          10. 涡旋震荡5秒,充分混匀细胞颗粒群

                          11. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

                          12. 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞(约80下)

                          13. 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管

                          14. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1

                          15. 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

                           

                          二、 测定准备

                           

                          1. 准备好待测样品,置于冰槽里

                          2. 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长412nm,间隔10分钟,读数4次(共30分钟),并置零 

                          3. 缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

                           

                          三、背景对照测定

                           

                          1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿

                          2. 加入xx微升底色液(Reagent E

                          3. 上下倾倒数次,混匀

                          4. 37℃温度下孵育3分钟

                          5. 加入50微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈

                          6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

                          7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(30分钟读数-0分钟读数)

                           

                          四、 样品测定

                           

                          1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿

                          2. 加入xx微升反应液(Reagent D

                          3. 加入xx微升底色液(Reagent E

                          4. 上下倾倒数次,混匀

                          5. 37℃温度下孵育3分钟

                          6. 加入50微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈

                          7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

                          8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(30分钟读数-0分钟读数)

                           

                          五、 计算样品活性

                            

                          六、酶标仪测定

                           

                          1. 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品

                          2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C到所有孔

                          3. 加入xx微升反应液(Reagent D到样品孔里

                          4. 加入xx微升阴性液(Reagent F到背景对照孔里

                          5. 分别加入xx微升底色液(Reagent E到所有孔里

                          6. 轻轻摇动96孔板

                          7. 37℃温度下孵育3分钟

                          8. 分别加入10微升待测样品(20微克蛋白)到所有孔里(注意:样品须清澈,且pH7.2

                          9. 轻轻摇动96孔板

                          10. 即刻放进酶标仪检测,包括(0分钟初始读数和30分钟读数)

                          11. 活性计算

                           

                           

                           

                           

                          注意事项

                           

                          1. 本产品为50次(96孔板,包括50次样品和50次背景对照)和12次(比色皿,包括12次样品和12次背景对照)操作

                          2. 本产品检测范围是401600毫单位/毫升

                          3. 操作时,须戴手套

                          4. 每次样品测定,需要背景测定一次

                          5. 样品须澄清,至关重要

                          6. 样品中避免含有EDTATWEEN20NP40、巯基乙醇、DTT等,否则干扰检测

                          7. 孵育反应完成后即刻进行比色测定

                          8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底

                          9. 建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1

                          10. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

                          11. 脂肪酶活性单位浓度定义:在37下,pH 7.5的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)水解1微摩尔三丁酸二巯基丙醇

                          12. 本公司提供系列医学生化检测试剂产品


                           
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